Annexin-V-FITC和PI双染检测细胞凋亡：
一、试剂：
FITC AnnexinV-PI 凋亡检测试剂盒（BD 公司，556570，100test）
AnnexinV 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。AnnexinV 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与 DNA 碎片检测比较，使用 AnnexinV 可以更早地检测到凋亡细胞。所以 AnnexinV 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如 PI)合并使用，来区分凋亡细胞与死亡细胞.
二、样本制备
1. 取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106细胞/ml的悬液。
3. Falcon试管中加入100μl细胞悬液。
4.按照试剂盒说明加入Annexin-V和PI试剂。注意阴性对照管和Annexin-V、PI单染管。
5. 轻轻混匀，室温（20°C ~25°C）避光处放置15分钟。
6. 各试验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400μl。
7. 1小时内上流式细胞仪测定结果。
三、流式上机检测：
1. 在 global worksheet 界面建立获取模板：一共画二个图：均为散点图。 第一个点图，横轴 FSC-A，纵轴 SSC-A，用 P1 门圈住目的细胞；
第二个点图，横轴 FITC AnnexinV，纵轴 PI，Show Population P1，在坐标轴 101 处画 十字象限门。
2.在 global worksheet 界面作两个图： a) 第一个图是 FSC-SSC 散点图;
b) 第二个图是相应荧光参数的散点图;
3. 上阴性样本管：
a) 先看第一张图，调整 FSC、SSC 电压和 FSC 阈值，使细胞群位于图中合适位置，作门 P1，圈住目的细胞群；
b) 先看第二张图，让第二张图显示 P1 门内的细胞群 show population-P1，调整相应 荧光通道电压，使得阴性细胞峰位于左下角荧光表达阴性区域内，沿阴性细胞群设 十字象限门。
c) 记录阴性样本管数据。
4. 所有条件保持不变，依次记录包括两个单阳补偿管在内的所有实验组样本管数据。
5. 选中两个补偿管，脱机调节补偿，并将补偿应用到各个采集管，分析统计结果。
注意事项：
1.细胞制备（如贴壁细胞）和储存时细胞膜的破损会导致磷脂酰丝氨酸(PS)跨膜分布的改变，造成假阳性。
2.染色后30分钟内立即上机检测。
