1. 流式细胞仪的工作原理：

将经特异性荧光染料染色后的待测细胞放入样品管中，细胞在气体的压力下进入充满鞘液的流动室,在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，通过激光器激发出散射光信号和荧光信号,由各自的激光检测器收集信号,再经光电倍增管(PMT)将信号放大,转变为电信号后由计算机系统进行分析.

2. 流式细胞仪检测的最大的特点：

能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。

3. 流式细胞仪的检测范围： 

细胞结构：细胞大小，细胞颗粒度，DNA含量与细胞周期，RNA含量，蛋白质含量等等；

细胞功能： 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原，细胞活性，细胞内/外的细胞因子，激素结合位点， 细胞受体，钙离子浓度，线粒体膜电位，等等

4. 流式细胞仪的基本结构： 液流系统， 光学系统和数据处理系统

（1） 液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。

（2） 光学系统:由激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片和光电倍增管组成。

（3） 数据处理系统:主要由计算机和及其软件（BD FACSDiva和BD ModFit）组成。 

5. 散射光的概念：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。 

（1）前向散射光（FS）： 激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号， 用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。通常我们选取前向散射光（FS）作为阈值来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。 

（2）侧向散射光（SS）： 激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

（3）光 散 射 测 量 的 用 途

测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析。光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群

6.荧 光 的 测 量：荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。

（1）常 见 的 荧 光 染 料：

（2）荧 光 信 号 的 检 测：

荧光信号的强弱， 反映了细胞抗原的表达含量， 荧光信号越强，抗原表达量越高；荧光信号越弱，抗原表达量越低。

使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析.

7. 荧光补偿：

（1）荧光补偿的概念：荧光在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射的光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。

（2）如何做荧光补偿：需要将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色，即几色分析就需要制备几个补偿对照管。如：Annexin-V-FITC和PI双染检测细胞凋亡，需要制备Annexin-V-FITC单染和PI单染两个补偿对照管。 

8. 数 据 的 显 示 与 分 析：

（1）常见参数：FS, SS, FL

FS（前向散射光）：反映颗粒的大小

SS（侧向散射光）：反映颗粒的内部结构复杂程度

FL（荧光）：反映颗粒被染上的荧光数量多少 

（2）数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图，等等）

单参数直方图： 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

（3）设 门 分 析 技 术：

门的设置：指根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门 。  

区阈的设置