一 试剂：

CycleTEST PLUS DNA  Reagent Kit（BD 公司，340242，40tests）

试剂 A（10ml）:含有胰蛋白酶，四氢氯化精胺去污剂，可用于分离实体组织片段，消化 细胞膜及细胞骨架。

试剂 B（8ml）:含有胰蛋白酶抑制剂，RNA 酶，柠檬酸盐缓冲液，四氢氯化精胺。用于抑 制胰蛋白酶的作用并消化 RNA。

试剂 C（8ml）:含有 PI 染液，四氢氯化精胺，柠檬酸盐缓冲液。PI 作用时的最终浓度至 少有 125ug/ml。

二、培养细胞 DNA 样本的制备 

1. 胰酶充分消化，加 PBS 吹打成单个细胞；

2.室温 500×g 离心 5 分钟，吸去上清液，加 1mlPBS 重悬；

3.。 室温 300×g 离心 5 分钟，吸去上清液，加 1mlPBS 重悬；

4.吸去上清液，加入 PBS 重悬细胞，调整细胞浓度到 1.0×106 细胞/ml； 

5.取上述浓度的细胞 1ml，室温 300×g 离心 5 分钟，吸去上清液，留下 100ul 左右悬 液；

6.混匀，加入 250ul A 液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置 10 分钟；

7. 加入 200ul B 液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置 10 分钟；

8.加入 200ul C 液，轻轻混匀，不要震荡，低温（2-8℃）避光静置 10 分钟；

9.用 300 目过滤尼龙网或 50um 尼龙网膜或 35um 细胞过滤器过滤细胞；

10.低温避光放置以待上机检测。建议在加入 C 液后 2 小时内上机，上机前轻轻混匀细胞悬液。

三、流式上机检测：

1、 在浏览框里建文件夹（DNA）和实验组（PI），样本（日期），1 个采集管（样品名称），并重命名。

2、 选择 Cytometer>View Configuration，确保当前的仪器设置包含了合适的参数，本实验需要添加一个 parameter，即 PI，蓝光激发，用 B 接收器接收。

3、 将“浏览框”的采集箭头选中采集管，点击“仪器框”的参数 parameter 页面，删除不必要的荧光参数，仅保留 PI。

4、 所有参数均设为线性，FSC、SSC、PI 选 A 面积信号，另外 PI 还需选择 W 宽度信号。阈值设为 PI，定为 5000。

5、 在 global worksheet 界面建立获取模板：

① 一共画三个图：前两个图为散点图，第三个为单参数直方图。 第一个点图，横轴 FSC-A，纵轴 SSC-A。

第二个点图，横轴 PI-W，纵轴 PI-A，。

第三个直方图，横轴 PI-A，纵坐标细胞计数。

② 选中第三张图：

⑴ 在100 和200 道数位置设两个间隔门 P1、P2。 并选择“Show Population Hierarchy”。

⑵ 单击右键，选择“Create Statistics View”，

6、上机检测：

①放样品在流式细胞仪上。确认调节机器、获取样本均为低速。

② 确认数据采集箭头指向该管；点击“Acquire”按扭。

③ 看第一张散点图，调整 FSC 和 SSC 电压，使图中细胞群显示在合适位置。

④ 看第二张 PI 散点图（横轴 PI-W，纵轴 PI-A），调节 PI 电压，使得 第一群单核细胞位于纵轴都在100 道数位置。

⑤ 看第三张 PI 直方图，观察单个细胞的 DNAG0-G1 峰也在100 道数位置，若不在100 道位置可以继续调节 PI 电压。

⑥ 调试结束后，在“采集控制框”里选择获取全部 10000 个微粒停止，记录数据。

四、数据导出：

1、 在“D：\BD Export\FCS”目录下，选择“File>New>Folder”命令，新建一个文件夹。

2、 双击打开要导出的实验组，选择“File>Export>Export FCS”命令。

3、 在“Export FCS Files（输出 FCS 文件）”窗口中选择导出文件格式 FSC2.0 或 FSC3.0， 点击 “OK”。

4、 在目录路径的最后，加上您在“驱动盘D：”中新建的文件夹的名字或者用对画框上的“Browser”找到新建文件夹的存储路径。

5、 单击“Save (保存)”。

五、数据分析（ModFIT 软件）

1、 在桌面上双击 ModFIT 图标，打开软件，OK-OK-进入软件主屏；

2、 在 File 下打开数据保存文件夹，文件类型设为 ALL File，选出待分析的文件；

3、 选择参数 Choose parameter of analysis，选 PI-A，双击；

4、 在设门中选择 Defile gate（根据需要，选择是否设门，设几个门）

²Gate 1：X 轴选 FSC，Y 轴选 SSC，OK，然后在图中圈出要分析的细胞；

²Gate 2：X 轴选 PI-W，Y 轴选 PI-A，OK，然后在图中圈出要分析的单个细胞；

²OK 后出现一个直方图。

5、 对这个图进行分析

²自动分析（点击工具栏中的 Auto 键）。

²手动分析

1）单击工具栏中的 Mod 键：选择分析所要的参数（是否有凋亡 Apoptosis， 是否有标准参照 Standard，是否有聚集体），选择有几个 Cycle（二倍体、 四倍体、异倍体），并对每一个循环是否有 S 期和 G2/M 期进行定义－OK;

2）确认每个峰的位置，并将 Range 放置于不同的峰上；

3）单击工具栏中的 Fit 键，软件开始以最小乘法拟合曲线，并进行统计；

6、 Save As 保存分析结果，Print 打印分析结果。

7、 报告中至少应包含以下信息：

⑴ DNA 倍体。G2/G1值.（即G2期是四倍体细胞，而G1期是二倍体细胞，比值应为1.8-2.0之间。若小于1.8，则细胞染色不充分

⑵ 主要 G1 峰的 CV；CV值称为变异系数，一般CV值越小，峰型越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。

⑶ S 期比例；

⑷ 必要的简单评价：如细胞数的不足、碎片较多、CV 太高等。